Количественное определение белка в моче колориметрическим методом с пирогаллоловым красным

Белок в моче: методы определения

Количественное определение белка в моче колориметрическим методом с пирогаллоловым красным

Патологическая протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи.

Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора.

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

  • Качественные,
  • Полуколичественные,
  • Количественные.

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

  1. Моча должна иметь кислую реакцию. Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 – 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).
  2. Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.
  3. Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.
  4. Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты.

Несмотря на это, в большинстве КДЛ в России эти методы широко используются в качестве скрининга – в моче с положительной качественной реакцией в дальнейшем проводят количественное определение белка.

Из качественных реакций чаще используют пробу Геллера и пробу с сульфосалициловой кислотой, однако пробу с сульфосалициловой кислотой большей частью считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии. Проба с кипячением в настоящее время практически не используется в связи с ее трудоемкостью и длительностью.

К полуколичественным методам относятся:

В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому при данном методе наблюдаются те же ошибки, что и при пробе Геллера.

В настоящее время для определения белка в моче все чаще используются диагностические полоски. Для полуколичественного определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой.

Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. Несмотря на большую популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы анализа мочи в целом и определения белка в частности не лишены серьезных недостатков.

Одним из них, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. В связи с этим, тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином.

При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями. Данный факт не дает возможности использовать данный метод определения белка в моче для оценки состояния почек (гломерулярного фильтра) в динамике.

При тубулярной протеинурии результаты определения белка также оказываются заниженными. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л).

Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.

Хлопья слизи с высоким содержанием гликопротеидов (например, при воспалительных процессах в мочевых путях, пиурии, бактериурии) могут оседать на индикаторной зоне полоски и приводить к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также быть связаны с высокой концентрацией мочевины. Плохое освещение и нарушение цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Корректное количественное определение белка в моче в ряде случаев оказывается непростой задачей. Трудности ее решения определяются следующим рядом факторов:

  • низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов;
  • присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;
  • значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые «рутинные» методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты.

С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:

  • обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;
  • должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;
  • обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;
  • быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);
  • обладать приемлемой стоимостью;
  • быть легко адаптируемым к автоанализаторам;
  • результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.

Ни один из известных к настоящему времени методов количественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта».

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

К турбидиметрическим методам относятся:

  • определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),
  • определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),
  • определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов.

О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению относительно воспроизводимых результатов.

Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя к так называемым «ложноположительным», либо «ложноотрицательным» результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастирующие йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты.

Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, но, несмотря на это, в настоящее время они широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов. Наиболее широко в России используется метод определения белка с сульфосалициловой кислотой.

Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков.

К ним относятся:

  1. биуретовая реакция,
  2. метод Лоури,
  3. методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:
    • Понсо S (Ponceau S),
    • Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)
    • пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

С точки зрения исполнителя, в повседневной работе лаборатории при большом потоке исследований биуретовый метод является неудобным из-за большого числа операций.

В то же время, метод характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций и выявлять альбумин, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью, вследствие чего биуретовый метод рассматривают в качестве референтного и рекомендуют для сравнения других аналитических методов обнаружения белка в моче. Биуретовый метод определения белка в моче предпочтительно выполнять в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, и использовать в тех случаях, когда результаты определения с помощью других методов представляются сомнительными, а также для определения величины суточной потери белка у нефрологических больных.

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы.

Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении содержания белка в моче.

Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой, углеводами).

Отделение этих и других компонентов мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота определения белка по связыванию красителей делают эти методы перспективными, однако высокая стоимость реактивов препятствует более широкому их использованию в лабораториях. В настоящее время в России все большее распространение получает метод с пирогаллоловым красным.

Проводя исследование уровня протеинурии, нужно иметь ввиду, что различные методы определения протеинурии имеют разную чувствительность и специфичность к многочисленным белкам мочи.

Исходя из эмпирических данных, рекомендуется определять белок двумя разными методами и рассчитывать истинное значение по одной из приведенных формул:

протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L; протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S; протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L; протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B; протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S; протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L;

где:
B – результат измерения с Кумасси G-250;
L – результат измерения с реактивом Лоури;
P – результат измерения с молибдатом пирогаллола;
S – результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Учитывая выраженные колебания уровня протеинурии в различное время суток, а также зависимость концентрации белка в моче от диуреза, различное его содержание в отдельных порциях мочи, в настоящее время при патологии почек принято оценивать выраженность протеинурии по суточной потере белка с мочой, то есть определять так называемую суточную протеинурию. Она выражается в г/сут.

При невозможности сбора суточной мочи рекомендуется определять в разовой порции мочи концентрации белка и креатинина. Поскольку скорость выделения креатинина в течение дня достаточно постоянна и не зависит от изменения скорости мочеотделения, отношение концентрации белка к концентрации креатинина постоянно.

Данное отношение хорошо коррелирует с суточной экскрецией белка и, следовательно, может использоваться для оценки выраженности протеинурии. В норме отношение белок/креатинин должно быть менее 0,2. Белок и креатинин измеряют в г/л.

Важным достоинством метода оценки выраженности протеинурии по соотношению белок-креатинин является полное исключение ошибок, связанных с невозможностью или неполным сбором суточной мочи.

  • О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, “Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии”, Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.
  • А. В. Козлов, “Протеинурия: методы ее выявления”, лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.
  • В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», – Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.
  • В.И. Пупкова, Л.М. Прасолова – Определение белка в моче и спинномозговой жидкости. Кольцово, 2007 г.
  • Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва, “Медицина”, 1975 г.

Источник: http://www.clinlab.info/Urinalysis/Urine-protein-test-53

Белок в моче – методы определения и границы нормы (современное состояние проблемы)

Количественное определение белка в моче колориметрическим методом с пирогаллоловым красным

ЮНИТЕКА:

Анализ мочи:

26.02.2009

Куриляк О.А., к.б.н.

В норме белок выделяется с мочой в относительно небольшом количестве, обычно не более 100–150 мг/сут.

Суточный диурез у здорового человека составляет 1000–1500 мл/сут; таким образом, концентрация белка в физиологических условиях составляет 8–10 мг/дл (0,08-0,1 г/л).

Общий белок мочи представлен тремя основными фракциями – альбуминами, мукопротеинами и глобулинами.

Альбумин мочи – это та часть альбумина сыворотки крови, которая была профильтрована в клубочках и не была реабсорбирована в почечных канальцах; в норме экскреция альбумина в моче составляет менее 30 мг/сут.

Иным главным источником белка в моче служат почечные канальцы, особенно дистальная часть канальцев.

Эти канальцы секретируют две третьих общего количества мочевого белка; из этого количества примерно 50% представлено гликопротеидом Тамма‑Хорсфалла, который секретируется эпителием дистальных канальцев и играет важную роль в формировании мочевых камней.

Иные белки присутствуют в моче в незначительном количестве и происходят из профильтровавшихся через почечный фильтр низкомолекулярных белков плазмы, которые не реабсорбируются в почечных канальцах, микроглобулинов из эпителия почечных канальцев (RTE), а также простатического и влагалищного отделяемого.

Протеинурия, то есть увеличение содержания белка в моче – один из наиболее значимых симптомов, отражающий поражение почек. Однако и целый ряд других состояний также может сопровождаться протеинурией. Поэтому различают две основные группы протеинурий: почечную (истинную) и внепочечную (ложную) протеинурию.

При почечной протеинурии белок проникает в мочу непосредственно из крови вследствие повышения проницаемости гломерулярного фильтра. Почечная протеинурия часто встречается при гломерулонефрите, нефрозе, пиелонефрите, нефросклерозе, амилоидозе почек, различных формах нефропатий, например нефропатии беременных, лихорадочных состояниях, гипертонической болезни и т.

д. Протеинурия может обнаруживаться и у здоровых людей после тяжелых физических нагрузок, переохлаждения, психологического стресса. У новорожденных в первые недели жизни наблюдается физиологическая протеинурия, а при астении у детей и подростков в сочетании с быстрым ростом в возрасте 7-18 лет возможна ортостатическая протеинурия (в вертикальном положении тела).

При ложной (внепочечной) протеинурии источником белка в моче является примесь лейкоцитов, эритроцитов, клеток эпителия мочевых путей уротелия. Распад этих элементов, особенно резко выраженный при щелочной реакции мочи, приводит к попаданию белка в мочу, уже прошедшую почечный фильтр.

Особенно высокую степень ложной протеинурии дает примесь крови в моче, при профузной гематурии она может достигать 30 г/л и более.

Заболевания, которые могут сопровождаться внепочечной протеинурией – мочекаменная болезнь, туберкулез почки, опухоли почки или мочевых путей, циститы, пиелиты, простатиты, уретриты, вульвовагиниты.

Клиническая классификация включает легкую протеинурию (менее 0,5 г/сут.), умеренную (от 0,5 до 4 г/сут.), или тяжелую (более 4 г/сут.).

У большинства пациентов с заболеваниями почек, такими, как острый гломерулонефрит или пиелонефрит выявляют умеренную протеинурию, но больные с нефротическим синдромом обычно выделяют с мочой более 4 г белка ежедневно.

Для количественного определения белка применяется широкий спектр методов, в частности, унифицированный метод Брандберга-Робертса-Стольникова, биуретовый метод, метод с применением сульфосалициловой кислоты, методы с использованием красителя кумасси синий, красителя пирогаллоловый красный и др.

Использование различных методов определения белка в моче привело к тому, что в трактовке границ нормы содержания белка в моче возникла серьезная путаница.

Поскольку наиболее часто в лабораториях используются 2 метода – с сульфосалициловой кислотой и красителем пирогаллоловый красный, рассмотрим проблему корректности границ норм именно для них.

С позиции сульфосалицилового метода в нормальной моче содержание белка не должно превышать 0,03 г/л, с позиции же пирогаллолового – 0,1 г/л! Различия троекратные!!!

Низкие значения нормы концентрации белков в моче при использовании сульфосалицилового обусловлены следующими моментами:

  • калибровочная кривая строится по водному раствору альбумина. Моча по своему составу очень сильно отличается от воды: рН, соли, низкомолекулярные соединения (креатинин, мочевина и др). Вследствие этого по данным Альтшулера, Ракова и Ткачева ошибка определения белка в моче может быть 3-х кратной и более! Т.е. корректные результаты определения могут быть получены только в тех случаях, когда моча имеет очень низкий удельный вес и по своему составу и рН приближается к воде;
  • более высокая чувствительность сульфосалицилового метода к альбумину в сравнении с другими белками (в то время, как было упомянуто выше, альбумин в нормальных образцах мочи составляет не более 30% от общего белка мочи);
  • если pH мочи сдвинута в щелочную сторону, происходит нейтрализация сульфосалициловой кислоты, что так же является причиной занижения результатов определения белка;
  • скорость седиментации преципитатов подвержена значительной вариации – при невысоких концентрациях белка преципитация замедлена, и ранняя остановка реакции приводит к занижению результата;
  • скорость реакции преципитации существенно зависит от перемешивания реакционной смеси. При высоких концентрациях белка активное встряхивание пробирки может приводить к образованию крупных хлопьев и их быстрому осаждению.

Все выше перечисленные особенности метода и приводят к значительному занижению определяемой в моче концентрации белка. При этом степень занижения сильно зависит от состава конкретной пробы мочи.

Поскольку метод сульфосалициловой кислоты дает заниженные значения концентрации белка то и граница нормы для этого метода 0,03 г/л тоже занижена примерно в три раза в сравнении с данными, которые приводятся в зарубежных справочниках по клинической лабораторной диагностике.

Подавляющее большинство лабораторий западных стран отказались от применения сульфосалицилового метода для определения концентрации белка в моче и активно используют для этих целей пирогаллоловый метод.

Пирогаллоловый метод определения концентрации белка в моче и других биологических жидкостях основан на фотометрическом принципе измерения оптической плотности окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии молекул белка с молекулами комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия (Pyrogallol Red–Molybdate complex).

Почему пирогаллоловый метод позволяет получать более точные результаты измерения концентрации белка в моче? Во-первых, за счет большей кратности разведения пробы мочи в реакционной смеси.

Если в сульфосалициловом методе отношение проба мочи/реагент составляет 1/3, то в пирогаллоловом методе оно может быть в пределах от 1/12,5 до 1/60 в зависимости от варианта методики, что значительно уменьшает влияние состава мочи на результат измерения. Во-вторых, реакция протекает в сукцинатном буфере, то есть при стабильном рН.

И, наконец, сам принцип метода, можно сказать, более «прозрачный». Молибдат натрия и краситель пирогаллоловый красный образуют комплекс с молекулой белка. Это приводит к тому, что молекулы красителя в свободном состоянии не поглощающие свет на длине волны 600 нм в комплексе с белком свет поглощают.

Таким образом, мы как бы метим каждую молекулу белка красителем и в результате получаем, что изменение оптической плотности реакционной смеси на длине волны 600 нм четко коррелирует с концентрацией белка в моче. Причем, поскольку сродство пирогаллолового красного к разным фракциям белка практически одинаковое, метод позволяет определять общий белок мочи.

Поэтому граница нормальных значений концентрации белка в моче составляет 0,1 г/л (она и указана во всех современных западных руководствах по клинико-лабораторной диагностике, в том числе и в «Клиническом руководстве по лабораторным тестам», под ред. Н. Тица). Сравнительные характеристики пирогаллолового и сульфосалицилового методов определения белка в моче представлены в Таблице 1.

В заключение, хотелось бы еще раз акцентировать внимание на том факте, что при переходе лаборатории с сульфосалицилового метода определения белка в моче на пирогаллоловый метод граница нормальных значений существенно повышается (с 0,03 г/л до 0,1г/л!). Об этом сотрудники лаборатории должны непременно поставить в известность врачей-клиницистов, т.к. при сложившейся ситуации диагноз протеинурия может быть поставлен только в том случае, когда содержание белка в моче превышает 0,1 г/л.

Список литературы.

  • Альтшулер Б.Ю., Раков С.С., Ткачев Г.А. // Вопр. мед. химии. – 2001. – № 4. – C.426-438.
  • Ким Ю.В., Потехин О.Е., Токар М.И., Шибанов А.Н. // Лаб. мед. – 2003. – № 6. – C.94-98.
  • Клиническое руководство по лабораторным тестам, под ред. Н. Тица.- М.- Юнимед-пресс.-2003.- 942 с.
  • Козлов А.В., Слепышева В.В. Методы определения белка в моче: возможности и перспективы // Сборник трудов VII ежегод. СПб нефрол. семинара. – СПб: ТНА. – 1999. – C.17-28.
  • Пупкова В.И., Пикалов И.В., Хрыкина Е.Н., Харьковский А.В. // Новости «Вектор-Бест». – 2003. – № 4 (30).
  • Chambers R.E., Bullock D.G., Whicher J.T. // Ann. Clin. Biochem. – 1991. – Vol. 28 (Pt 5). – P.467-473.
  • Clinical Laboratury Medicine. Ed. by Kenneth D. McClatchey. – 2nd ed.-2001.- 1993p.
  • Eppel G.A., Nagy S., Jenkins M.A., Tudball R.N., Daskalakis M., Balazs N.D.H., Comper W.D. // Clin. Biochem. – 2000. – Vol. 33. – P.487-494.
  • Franke G., Salvati M., Sommer R.G. Composition and device for urinary protein assay and method of using the same // ПатентСША № 5326707. – 1994.
  • Kaplan I.V., Levinson S.S. // Clin. Chem. – 1999. – Vol. 45. – P.417-419.
  • Kashif W., Siddiqi N., Dincer H.E., Dincer A.P., Hirsch S. // Cleveland Clin. J. of Med. – 2003. – Vol. 70 (6). – P.535-547.
  • Koerbin G, Taylor L, Dutton J, Marshall K, Low P, Potter JM. // Clin. Chem. – 2001. – Vol. 47. – P.2183-2184.
  • Le Bricon T., Erlich D., Dussaucy M., Garnier J.P., Bousquet B. // Article in French. – Ann. Biol. Clin. (Paris). – 1998. – Vol. 56 (6). – P.719-723.
  • Marshall T., Williams K.M. // Clin. Chem. – 2003. – Vol. 49 (12). – P.2111-2112.
  • Pugia M., Newman D.J., Lott J.A., D’Mello L., Clark L., Profitt J.A., Cast T. // Clin. Chim. Acta. – 2002. – Vol. 326 (1-2). – P.177-183.
  • Ringsrud K.M., Linne J.J. Urinalysis and body fluids: A ColorText and Atlas // Mosby. – 1995. – P.52-54.
  • Shepard M.D., Penberthy L.A. // Clin. Chem. – 1987. – Vol. 33. – P.792-795.
  • Williams K.M., Marshall T. // J. Biochem. Biophys. Methods. – 2001. – Vol. 47. – P.197-207.
  • Williams K.M., Arthur S.J., Burrell G., Kelly F., Phillips D.W., Marshall T. // J. Biochem. Biophys. Methods. – 2003. – Vol. 57 (1). – P.45-55.

Источник: https://unimed.ru/biblioteka/analiz-mochi1/belok-v-moche-%E2%80%93-metody-opredeleniya-i-granicy-normy-sovremennoe-sostoyanie-problemy.html

Персональный сайт – Определение белка в моче с пирогаллоловым красным

Количественное определение белка в моче колориметрическим методом с пирогаллоловым красным

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для колориметрического определения белка в моче и спинномозговой жидкости с пирогаллоловым красным

Состав набора:

200 мл (2 х 100 мл Р + 2 х 2 мл калибратор)

500 мл (2 х 250 мл Р + 2 х 5 мл калибратор)

Принцип метода

При взаимодействии белка с пирогаллоловым красным и

молибдатом натрия образуется окрашенный комплекс,

интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации

белка в пробе.

Состав набора

Реагент (Р) – раствор пирогаллолового красного в сукцинатном

буфере, готовый к использованию.

Калибраторы – калибровочные растворы белка с низкой (0,20

г/л, используется для определения микропротеинурии) и высокой

(0,50 г/л, используется для определения протеинурии)

концентрацией белка, содержащие 70% альбумина и 30%

глобулина, готовые к использованию.

Хранение набора– при температуре 2-8°С в упаковке

предприятия-изготовителя в течение всего срока годности.

Стабильность реагента и калибраторов

После вскрытия реагент стабилен 6 мес, калибраторы – 3 мес. при хранении их в плотно закрытом виде при температуре 2-8°С в защищенном от света месте.

Нормальные величины

  • моча – до 0,120 г/л (до 0,141 г/сут);
  • спинномозговая жидкость (СМЖ) – 0,150-0,450 г/л.

Пробы для анализа

Моча, негемолизированная СМЖ.

Подготовка к анализу

  1. СМЖ и мочу центрифугировать 10 мин при 2700-4000 об/мин.
  2. Для проведения анализа использовать чистые, хорошо вымытые пробирки. Тестом на пригодность пробирок для анализа является отсутствие изменения цвета реагента. Если реагент синеет без добавления пробы – результаты определения белка будут завышены; поэтому следует сначала раскапать реагент, а затем добавлять мочу.
  3. При постановке метода следует использовать новые кюветы, так как они не окрашиваются реагентом и реакционной пробой. Старые пластиковые кюветы (мутные, не прозрачные) не пригодны для измерения. Кюветы, бывшие в работе, перед использованием обработать следующим образом: выдержать 10 мин в моющем растворе (200 мл 5% раствора перекиси водорода или 1 мл моющего средства), после чего ополоснуть водопроводной и дистиллированной водой не менее 10 раз. Набор пригоден для проведения анализа на биохимических полуавтоматических и автоматических анализаторах.

Проведение анализа Длина волны: 598 (578-620) нм; длина оптического пути: 10 мм; температура: 18-25°С.

Реагент и калибратор перед проведением анализа выдержать при комнатной температуре около 30 минут.

Процедура 1 (определение протеинурии)

Пробы перемешать, выдержать 10 мин при комнатной температуре (18-25°С). Измерить оптическую плотность опытной (Е) и калибровочной (Ек) проб против контрольной (холостой) пробы. Окраска стабильна в течение 1 ч.

Отмерить, мкл

Опытная проба

Калибро­вочная проба

Контрольная

(холостая)

проба

Калибратор, 0,50 г/л

20

Проба

20

Вода дистил.

20

Реагент

1000

1000

1000

Аналитические характеристики (для процедуры 1)

Линейность – в диапазоне 0,070 – 2,00 г/л; чувствительность – не более 0,060 г/л; коэффициент вариации – не более 5%.

Процедура 2 (определение микропротеинурии)

Отмерить, мкл

Опытная проба

Калибро­вочная проба

Контрольная

(холостая)

проба

Калибратор, 0,20 г/л

100

Проба

100

Вода дистил.

100

Реагент

1000

1000

1000

Перемешать, выдержать 10 мин при комнатной температуре (18-

25°С). Измерить оптическую плотность опытной (Е) и

калибровочной (Ек) проб против контрольной (холостой) пробы.

Окраска стабильна в течение 1 ч.

Аналитические характеристики (для процедуры 2)

Линейность – до 0,40 г/л;

чувствительность – не более 0,010 г/л;

коэффициент вариации – не более 5%.

Расчет

Концентрацию белка в пробе (С) в г/л рассчитать по формуле:

С =Е/Ек х Ск . где

Ск – концентрация белка в калибраторе, г/л.

Примечания

  1. Если концентрация белка в пробе превышает 2,00 г/л, пробу разбавить физиологическим раствором: мочу в 3 раза, СМЖ в 5-10 раз. Результат умножить на коэффициент разбавления.
  2. Для проверки линейности использовать набор калибровочных образцов белка Новосо-БМ-ПГК, в котором белковый состав калибровочных образцов аналогичен белковому составу калибраторов набора.

Меры предосторожности

При работе с реагентом не следует допускать его попадания на

кожу. При попадании реагента на кожу тотчас промыть

пораженное место проточной водой.

Источник: http://bioximia.narod.ru/index/0-305

МоиБолезни
Добавить комментарий